结直肠息肉是从结直肠壁突出到肠腔的肿块。结直肠腺瘤（Colorectal adenoma, CA）是最常见的发生癌变的息肉类型，由几种形态类型组成，而不是一种实体。根据最新的分类系统,它可分为常规腺瘤和固着的锯齿状息肉。CA，特别是是高危结直肠腺瘤（high-risk CA, HRCA），是一种高患病率和复发率的癌前病变，约占全世界偶发性结直肠癌病例的90%。HRCA是正常粘膜向腺癌过渡的一个特殊阶段，癌变率约为25%。虽然结肠镜检查是发现和切除癌前CA以预防癌的有效方法，但这种侵入性手术是频繁和痛苦的。然而，目前复发性CA只能通过多次侵袭性息肉切除术来治疗，这极大地阻碍了患者的积极参与，特别是对于复发或多发CA的患者。而由于缺乏可靠的CA相关药物体外筛选模型，仍缺乏安全、有前景的药物发明策略。针对HRCA的药物研发的主要困难是缺乏用于药物筛选和机制研究的体外模型。类器官培养系统较好地模拟细胞在体内的生长环境，能够准确地保持原始器官或组织的细胞、分子和功能特征。对于肿瘤患者来源的类器官（patient derived organoids , PDOs）能够很好的复现个体的异质性突变和癌症治疗反应，在癌症建模和个性化医疗方面具有很大的前景。由于类器官可以在体外扩增和操作，PDOs具有较好的临床应用前景，尤其是大规模应用药物筛选和精准化治疗。
2023年9月4号，bat365在线平台类器官研究院赵冰团队在BMC Medicine杂志在线发表了题为“Establishment of a large-scale patient-derived high-risk colorectal adenoma organoid biobank for high-throughput and high-content drug screening”的研究论文，他们成功建立了一个由来自33名患者的37个人类高危结直肠腺瘤衍生的类器官（HRCA-PDOs）组成的生物库。HRCA-PDO保留了个体粘膜向癌转化的组织病理学特征和遗传指纹。基于该类器官生物库，他们建立了高通量、高含量的筛选平台，并进行了迄今为止第一次HRCA的药物筛选。在139种药物中，他们筛选出了包括二甲双胍在内的4种具有抑制HRCA-PDO生长潜力的候选药物。
为了研发针对HRCA的潜在药物，研究人员尝试建立体外培养的HRCA-PDOs用于药物筛选。基于已有的培养方法建立了不添加wnt3a的培养体系，在7天内即可获得HRCA-PDOs并且可以传代培养数月。经检测此方法能够培养出高纯度的HRCA-PDOs，为后续的药物筛选打好基础（图1）。
图1：无wnt3a体系中培养的HRCA-PDOs。
为了研究HRCA-PDOs和原始腺瘤之间的关系，研究人员通过H&E染色和免疫荧光染色发现HRCA-PDOs能够很好的保留个体特异的形态学特征（图2-A），能够表达mucin2（图2-B），HRCA-PDOs和对应的CA的c-myc和ki67表达类似（图2-C）。为了进一步确认HRCA-PDOs的突变和原始腺瘤的一致性，研究人员提取了原始腺瘤和对应类器官的DNA进行分析，结果显示APC, Smad4和TP53这些常见的导致结直肠癌的突变仍然存在于HRCA-PDOs中，但是KRAS和DNAH3突变只存在于HRCA-PDOs中（图2-D），综合分析发现HRCA-PDOs和对应的原始腺瘤大约40%的突变是相同的（图2-E），这个不一致性可能是由于腺瘤细胞在HRCA-PDO和对应的原始腺瘤组织中的比例不同造成的。
图2：HRCA-PDOs保留了原始腺瘤的组织病理学特点，突变图谱和分子特征。
为了进一步研究病人来源的类器官和原始腺瘤之间的联系，研究人员收集原始腺瘤，对应的正常粘膜组织和对应的PDOs测序进行了转录组分析，结果发现在腺瘤和与之对应的正常黏膜组织中有3511个差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)，这些DEGs在PDOs中的表达和原始腺瘤中类似（图3-A）。基因富集分析进一步证实PDOs整体上保留了原始腺瘤的分子生物学特征（图3-B）。转录组分析同时也发现在原始腺瘤和对应的PDOs中结肠干细胞的基因表达上调包括OLFM4, LGR5, c-Myc和CD166（图3-A）。免疫荧光染色也证实了OLFM4在CA和PDOs中相对于正常黏膜表达上调（图3-C）。为了验证这些基因是否可以作为CA的标志物，将测序数据进行GEO分析，在CA富集到LGR5, OLFM4, c-Myc, CD44和 CD166（图3-D），和前面的实验结果一致，说明具有普遍性。值得注意的是一些认可的结直肠癌标志物（CD24, CD133和 EpCAM）在CA中的表达相对于正常粘膜组织并未显著升高（图3-D-E），说明CA处于粘膜向肿瘤的过渡阶段。研究人员同时比较了GEO数据库中结直肠癌类器官的转录组数据和本研究中原始腺瘤，正常粘膜组织和PDOs的转录组数据，结果显示结直肠癌类器官和CA完全不同（图3-F）。综上所述，HRCA-PDOs保留了原始腺瘤的生理学和病理学特征，是一种理想的研究腺瘤的模型。
图3：培养的HRCA-PDOs保留了CA的分子生物学特征。
基于建立的HRCA-PDOs库，研究人员建立了高内涵和高通量的药物筛选平台，139种化合物用来做药物筛选，其中包含19中FDA认证的CA相关的药物。在这139种化合物中筛选到抑制效果最明显的13个小分子化合物。为了进一步证实筛选到的药物对不同的HRCA-PDOs的广泛抑制作用和比较其效果，研究人员评估了这些药物处理后细胞的活性。结果显示metformin, BMS754807, panobinostat和AT9283对14个HRCA-PDOs都有一致的抑制作用。Metformin是FDA认证的具有很高安全性的一种药物，研究人员进一步研究了其抑制HRCA-PDOs生长的机制。体内外研究结果显示metformin通抑制的CA的干性维持而减缓CA的发展。本研究通过建立一个大规模的HRCA-PDOs生物库，基于生物库的高通量和高含量药物筛选出针对HRCA的潜在治疗药物，并确定了可以用作HRCA诊断和预后的生物标志物的干性特征基因,为CA的预防和治疗提供了新的方法。
bat365在线平台类器官研究院院长赵冰教授为本文的共同通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金，上海市科委，云南省重点研发计划，上海市重点临床专业，上海基础研究试点计划（复旦大学）等经费支持。
作者简介
赵冰
bat365在线平台
赵冰，bat365在线平台类器官研究院院长，国家优青、国家重点研发计划“干细胞及转化研究”首席科学家（青年）。研究成体干细胞命运决定机制，发展类器官培育新策略。
