把肝脏细胞用于基础研究和再生医学需要完全掌握肝细胞分化和成熟的调控因子，但是通过数据分析寻找关键调节因子的一个巨大挑战就是转录因子的表达量极低，单细胞测序中的噪音和信息丢失而难以精确的估计。此外，在转录过程中往往是转录因子的活性发生改变促进细胞命运的转化而不是表达量，使得肝细胞分化的关键调节因子的寻找成为一个难题。
2023年10月31日，bat365在线平台类器官研究院赵冰教授团队联合北京协和医院的王晓月课题组在Genome Biology上发表了题为“In-organoid single-cell CRISPR screening reveals determinants of hepatocyte differentiation and maturation”的研究论文。该研究开发出一套基于类器官模型的单细胞CRISPR筛选及基于调节子分析的研究框架—OSCAR (Organoid-based Single-cell CRISPR screening Analyzed with Regulons)，并利用该框架解析和验证了新的肝细胞分化成熟调控因子。
肝脏是控制代谢、分泌、解毒的重要器官，肝实质细胞作为执行肝脏代谢功能主要细胞，其分化成熟过程则显得尤其重要。前人研究发现肝实质细胞分化成熟受转录因子严格调控（如FOXA2, HNF4α和 CEBPA等）。体外诱导肝实质细胞分化方法（如iPSC诱导系统）仍无法实现肝细胞的完全成熟，这也提示肝实质细胞分化成熟的机制仍需进一步解析。目前已报道不同发育阶段的肝脏单细胞转录组数据，但仅基于整体转录组解析出的相关性仍不足以反映真实的调控关系，这意味着以高通量筛选为代表的正向遗传学对理解该问题有着巨大前景。
联合团队针对目前高通量筛选技术应用该领域的困难给予了全套完整的解决或优化方案（如图1所示）。首先，针对2D培养基与体内组织环境的相似性不足问题，团队应用成体干细胞驱动的肝内胆管细胞类器官（ICOs）实现了原生组织的结构与功能的捕捉；其次，针对仅以细胞表型或少数分子标记作为筛选指标无法解析复杂基因调控网络的问题，团队应用优化后的CROP-seq实现了高通量扰动下全基因转录组的分子表型效应量表征；最后，针对单细胞转录组测序的数据稀疏性和转录因子的普遍低表达量问题，团队应用基于调节子概念的特征组合，以转录因子活性而不是转录因子表达量（如图2所示），稳定跟踪转录调控节点的上下游关系，且大幅度降低需求细胞数量。
图1. OSCAR筛选实验方案
图2. 调节子(Regulons)分析方案
通过OSCAR方案，团队鉴定了两组增强或减弱肝细胞分化和成熟过程的调节子（如图2所示），并根据其对肝细胞标志物表达的调节作用进行了排序。团队发现在强力调节子中，活化蛋白-1（AP-1）转录因子的组分c-Fos受到干扰时，可加速肝细胞分化和成熟，对此团队回到类器官中，进行了详细的功能验证，发现在小鼠和人的胆管类器官中敲除c-Fos均促进实质细胞的分化和成熟，证实了OSCAR方案的可靠性。该工作对理解肝脏发育和挖掘细胞命运调控因子提供了新的研究范式。
bat365在线平台类器官研究院院长赵冰教授为本文的共同通讯作者。该研究得到了国家重点研发计划，国家自然科学基金，CAMS医学科学创新基金（CIMS），国家高水平医院临床研究基金，云南省重点研发计划，国家重点实验室专项基金等经费支持。
作者简介
赵冰
bat365在线平台
赵冰，bat365在线平台类器官研究院院长，国家优青、国家重点研发计划“干细胞及转化研究”首席科学家（青年）。研究成体干细胞命运决定机制，发展类器官培育新策略。
