人类个体间显著的生理差异导致药物代谢和药效反应存在较大的差异。因此，评估特定药物对疾病影响的研究必须在高度同质化的模型中进行，以准确控制研究变量。小鼠和体外培养的细胞是药效评估常用的传统模型。然而，2D培养的细胞缺乏器官结构和功能，不适合开展药物筛选和毒理研究；动物模型开展体内药物测试存在工作量大和成本高的缺陷，也不适合开展大规模的药物测试。3D类器官模型具有自我更新和自我组装能力，能有效地在体外重现与原组织相似的结构和功能，提高了药效学评估的可靠性和真实性。近年来，利用肝脏、结肠、肺、肾、前列腺、胰腺、胃、大脑皮层和视网膜等组织的类器官进行体外药物评价的工作指出通过评估类器官的命运状态能有效监测药物疗效、识别药物作用机制。然而，现有的评估类器官命运状态的方法，如RT-qPCR和免疫荧光定量，通常需要破坏类器官，这限制了它们在长期动态监测中的应用。因此，开发非侵入性的检测技术，保持类器官微环境稳定并确保不同评估阶段的一致性，对于提高药物评估的准确性至关重要。
2024年8月30日，bat365在线平台类器官研究院院长赵冰教授团队在Chemical Engineering Journal杂志在线发表了题为“Drug evaluation platform based on non-destructive and real-time in situ organoid fate state monitoring by graphene field-effect transistor”的研究论文，他们介绍了一种基于场效应晶体管的非破坏性、实时原位检测平台（NDRS-FET），并将其应用于基于类器官命运状态的药效评估。他们以肝类器官为模型，利用NDRS-FET平台成功评价了OSM、FH1和BG45对肝类器官命运的调控作用，建立了候选化合物对细胞命运转变的动态模型。通过构建这些药物的动态模型，实时评价其在肝类器官分化过程中的药效，预测和模拟这些药物在不同时间点对肝脏分化的影响。相比以往的评估体系，NDRS-FET平台能无损、实时精准捕获原位类器官对药物的反应，减少了样本偏差，提高了药物评估的精度。
传统的类器官培养需要经历组织分离、扩增、分化等多个步骤（图1-A）。RT-qPCR和免疫荧光定量分析等常用于评价类器官状态的方法也需要RNA提取、蛋白染色等多个步骤（图1-B），这些操作往往破坏了类器官的生长环境。另外，评估类器官在不同分化阶段对药物的响应需要设置多个实验组，增加了组间偏差和异质性，限制了对类器官命运的全面准确评估。为了克服这些限制，研究人员提出了一种能实时、无损检测类器官命运状态的NDRS-FET药物评价平台。NDRS-FET平台分为三个区域：药物-类器官作用区、标志物传输区和信号评估区将分离的肝导管与基质胶均匀混合并接种到Transwell小室中，并添加靶药物对类器官进行3D培养。药物的刺激会促进类器官分泌相应的生物标志物，这些生物标志物可通过Transwell室底部的聚碳酸酯膜进入微通道传输区域。最终传送到含有液门石墨烯场效应晶体管（FET）区，FET对异源掺杂高度敏感，用作信号转导平台，实现实时量化标志物并进行动态建模（图1-C）。该平台的主要组成部分包括：分为传感区（右侧）和非传感区（左侧）的玻璃基板、包含药物-类器官作用区（左侧）、标志物传输区（中间）和信号评估区（右侧）的类器官检测腔室，能够实现药物-类器官共培养且底部有孔径3.0μm的聚碳酸酯膜便于分泌物通过的Transwell小室以及用于防止细胞/类器官受到细菌污染和培养基蒸发的可插入向G-FET设备的石墨烯表面提供栅极电压Ag/AgCl电极的盖子（图1-D）。NDRS-FET装置实现了类器官的非破坏性原位长期培养和检测，并充分评估了与类器官生长过程相关的信息。理想情况下，NDRS-FET能有效克服群间偏差，保证信号的同质性和一致性。
图1：NDRS-FET平台的构建。
随后，研究人员对NDRS-FET的制备与功能表征通过多种方法进行了验证。研究人员首先利用PBASE对石墨烯进行功能化，并利用氨基修饰探针抗体与琥珀酰亚胺基团之间形成的共价键确保探针抗体安全地附着在石墨烯表面，使其能够捕获白蛋白（Albumin）（图2-A）。通过透射电子显微镜（TEM）和选区电子衍射（SAED）证明制备的石墨烯是单层的，具有典型的六方阵和拉曼能带（图2-B-C-D）。通过分析NDRS-FET的输出特性曲线和传递特性曲线，可以看出该传感器为n型掺杂，具有典型的双极场效应特性（图2-E-G）。44个制备的NDRS-FET器件的中性点（Vcnp）位置的电压聚集在-50 mV至-60 mV的范围内，显示出高度的制造均匀性（图2-H）。电流退火方法的使用显著提高了NDRS-FET平台在信号传导过程中电性能的稳定性（图2-I）。转移特异性曲线显示，功能化后，PBASE修饰使Vcnp左移71 mV，抗体引入使Vcnp右移47 mV，白蛋白加入使Vcnp继续右移30 mV，这些变化归因于静电门控效应（图2-J）。光谱学表征显示，PBASE修饰后2D峰红移14 cm-1，抗体和白蛋白固定后2D峰蓝移，UV-Vis光谱显示PBASE修饰后吸收光谱红移10 nm，抗体固定后在289 nm处出现强吸收峰，白蛋白结合后吸收光谱蓝移（图2-K-L-M-N-O）。对照实验和选择性评估表明，传感器对白蛋白具有高特异性和选择性（图2-P-Q）。
图2：NDRS-FET的制备，探针抗体的功能化和固定化。
白蛋白是由肝脏细胞特异分泌的蛋白质，ALB的分泌量能反映肝类器官的命运状态。为了验证NDRS-FET平台是否能实时评估类器官的命运状态，研究人员对该平台捕获ALB信号的能力进行检测（图3-A）。连续10天记录无任何添加物下Vcnp值的变化结果显示了功能化后的FET稳定性良好（图3-B）。随着在FET试验缓冲液PBS中逐步增加白蛋白浓度，Vcnp持续向正栅极电压方向移动，结果分析显示白蛋白的检测限（LOD）可低至10 pg/mL（图3-C-D），这说明功能化的FET可灵敏地捕获白蛋白。考虑到类器官培养需在特定的培养基中进行，研究人员进一步检测功能化的FET是否能捕获培养基中的白蛋白信号。相同的，研究人员观察到随着培养集中添加白蛋白浓度的逐步上升，Vcnp同样持续向正栅极电压方向移动，结果显示培养基中白蛋白的LOD可达1 pg/mL（图3-E-F），这也暗示了在类器官培养基中白蛋白的检测灵敏度优于在PBS缓冲液中，从而验证了所制备的场效应管在检测培养基中类器官分泌的白蛋白方面的潜力。此外，NDRS-FET的定量性能与ELISA相当（图3-G），具有高灵敏度、特异性和稳定性。
图3：外源性白蛋白的敏感性和定量检测。
研究人员进一步评估NDRS-FET平台是否能准确捕获类器官命运状态的变化。他们将肝导管与基质胶混合物加载到Transwell腔室底部进行培养，并利用微通道将由分化后的类器官分泌的白蛋白传输至信号评估区记录白蛋白的电信号，从而构建动态模型（图4-A）。在培养过程中通过添加不同的培养基（包含了维持类器官正常生长的扩增培养基EM和促进类器官分化的培养基DM）来改变类器官的命运状态，同时进行数据追踪。结果显示，NDRS-FET平台培养的类器官无论是在形态学还是分子水平上均与传统24孔板中培养的类器官相似，证实了该平台支持稳定的类器官培养（图4-B-C-D）。通过实时原位长期检测白蛋白的分泌来监测肝脏类器官的分化状态，研究人员观察到随着培养时间的增加，转移特性曲线持续正向移动（图4-E），说明了肝类器官的分化会伴随白蛋白的分泌。结果分析显示ΔVcnp随时间呈现出强烈的非线性响应且在分化第8天达到峰值（图4-F），说明随着分化时间的推移，肝类器官持续分化，到第8天后分化完成。采用差分法构建dΔVcnp/dt-Days曲线来分析肝类器官分化过程中白蛋白分泌率的变化，结果显示白蛋白分泌率在第3天达到峰值后逐渐下降的趋势（图4-G）。上述结果提示，NDRS-FET平台提供的类器官分化的无损实时原位连续监测为药物评价提供了重要的动态模型。
图4：用NDRS-FET记录的类器官命运的动态。
最后，基于以前的评估和验证，研究人员利用NDRS-FET平台进行了药物药效的评估。实验选择了三种已知影响肝细胞分化的分子：OSM（促进成熟）、FH1（增强分化和成熟）以及BG45（抑制分化）。在为期10天的培养期内，四种条件（DMSO空白、OSM、FH1和BG45）分别应用于四个传感器中的类器官，并通过NDRS-FET记录每日白蛋白分泌情况（图5-A-B-F-J-N）。结果显示，不同药物处理后的转移特性曲线向正栅极电压方向移动的程度各异，反映了药物对类器官的不同影响（图5-C-G-K-O）。具体而言，OSM和FH1显著促进了白蛋白分泌，最大ΔVcnp位移分别为77.7 mV和75.4 mV，高于空白组的71.8 mV；而BG45则抑制了白蛋白分泌，最大ΔVcnp位移为60 mV，低于空白组（图5-H-L-P）。此外，dΔVcnp/dt-天数曲线表明，OSM和FH1加速了白蛋白分泌率，在第3天和第4.5天达到峰值，比空白组提前约2天和0.5天，而BG45则将分泌高峰延迟至第6天（图5-E-I-M-Q）。综上所述，NDRS-FET平台成功地区分了促进肝类器官分化的OSM和FH1与抑制分化的BG45，展示了其作为实时监测工具在药物评价方面的巨大潜力。
图5：NDRS-FET药物评价平台。
综上，该研究开发了一种基于NDRS-FET生物传感器的药物评价平台，可用于无损、实时原位连续监测类器官命运状态，最终用于药物药效的准确评价。该传感平台集成了定制的培养装置和石墨烯FET传感器，有效减少了样本间的偏差，并通过构建动态模型连续评估药物对类器官的影响。利用该平台，研究人员构建了OSM、FH1和BG45的动态模型，准确评估了这些药物在不同时间点对肝类器官分化的影响。NDRS-FET传感技术的开发对于未来进一步理解肝类器官命运的调控机制和相关药物的开发至关重要。
bat365在线平台类器官研究院院长赵冰教授为本文的共同通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金，云南省重点研发计划，山东省自然科学基金项目，江西省重点研发计划，“一带一路”创新人才交流项目等经费支持。
作者简介
赵冰
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赵冰，bat365在线平台类器官研究院院长，国家优青、国家重点研发计划“干细胞及转化研究”首席科学家（青年）。研究成体干细胞命运决定机制，发展类器官培育新策略。
